细胞培养板规格与培养
雷公藤甲素诱导正常人肝细胞L02细胞培养板规格的毒性及甘草酸二铵细胞培养板规格的保护作用
Cytotoxicity effects of triptolide in normal human hepatic cell L02
and protective effects of diammonium glycyrrhizinate
作者单位
淡墨，闻镍，刘丽，李佐刚
中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心
药物非临床安全评价研究北京市重点实验室
摘要
目的：研究雷公藤甲素( triptolide，TP) 诱导的正常人肝细胞L02的毒性及甘草酸二铵(diammonium glycyrrhizinate，DG)保护作用。
方法：首先利用CCK－8法测定不同浓度TP对L02的毒性，然后研究DG预处理48h后对TP诱导L02毒性的影响。
利用活性氧( ROS) 探针结合高内涵，研究不同浓度DG预处理对TP诱导L02ROS的影响。
进一步利用CYP3A4苯妥因诱导剂和酮康唑抑制剂阐明肝药酶在DG解毒中的作用。
结果：经细胞计数试剂盒( cell counting kit，CCK－8) 法测定，L02经TP孵育1、2和4h时， IC50分别为26、14 和8μmol·L－1。
当正常人肝细胞经DG( 10、100 和1000μmol·L－1) 预处理48h后，再与TP共同孵育1h，DG10 和100 μmol·L－1组的IC50分别升高至58、79μmol·L－1，而DG1000μmol·L－1组的IC50则降低至18μmol·L－1。
TP诱导L02产生ROS呈现明显剂量相关性。DG( 10 和100μmol·L－1) 预处理48h后可明显降低TP诱导ROS的能力。
CYP3A4的诱导剂与DG共同预处理后，可显著性降低TP诱导ROS的能力。
CYP3A4的抑制剂和DG共同预处理，反证诱导CYP3A4可能是DG保护作用的机制之一。
结论：本研究提示TP诱导L02的活性氧( reactive oxygen species，ROS) 水平增加，产生毒性作用；低浓度和中浓度DG可以显著性降低TP对L02的毒性，而高浓度DG反而增强TP对L02的毒性。
DG诱导CYP3A4上调和降低ROS水平对减轻TP诱导的正常肝细胞毒性起到重要作用。
正文
雷公藤甲素( triptolide，TP) 是从雷公藤中分离出的生物活性最高的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其相关效价比雷公藤总苷高100 ～ 200倍。
TP具有显著的免疫抑制、抗炎和抗肿瘤等活性，同时具有肝脏、肾、心脏和生殖系统等多脏器毒性。
不同程度的肝损伤是TP最常见的临床毒副作用之一。
雷公藤制剂引起的肝损害主要为实质细胞的损伤和坏死，其临床表现类似于急性病毒性肝炎，主要有乏力、食欲缺乏、厌油、恶心、呕吐、黄疸、肝大、伴压痛等。
实验研究表明TP通过诱导氧化应激、线粒体损伤等机理引发肝毒性。
动物实验研究进一步显示TP可以显著抑制肝药酶CYP3A的活性。
亦有体外研究表明肝药酶在TP引起的正常肝细胞毒性中起着至关重要的作用。
中国传统医学把甘草( Glycyrrhizae Radix et Rhizoma) 作为能解百毒的良药，其主要药用部位为其根及根茎。
现代药学研究发现甘草具有肝药酶诱导作用，与其他药物联用后，可能改变药物代谢行为，如半衰期、代谢成分和排泄等，从而影响药物药效和毒性。
甘草酸是中药甘草根部提取物中的重要成分之一。
以往研究证明，甘草酸是甘草中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗溃疡、抗氧化、保肝等作用。
进一步研究指出甘草酸二铵( diammonium glycyrrhizinate，DG) 可以通过上调肝药酶从而起到解毒的功效。
虽然文献报道甘草与TP配伍能显著降低雷公藤的毒性，但是关于其减毒作用机制缺少深入研究。
DG是否可以通过上调肝药酶来降低TP诱导的正常人肝细胞(L02) 的毒性尚为未知。
本实验利用L02结合高内涵、酶抑制诱导等方法，研究TP对正常肝细胞的毒性、不同浓度DG对TP肝毒性的保护作用，并进一步研究CYP3A4在TP诱导肝细胞活性氧( reactive oxygen species，ROS) 及DG通过降低ROS从而起到减轻TP肝细胞毒性中的作用。
材料
1
细胞
L02由中国科学院上海细胞库提供。
2
药物、试剂及仪器
TP对照品( 中国食品药品检定研究院，批号111567－200603，纯度99. 3%) ，苯妥因(phenytoin，PT)对照品(中国食品药品检定研究院，批号100210－201303，纯度99. 0%)
酮康唑(ketoconazole，KN) 对照品(中国食品药品检定研究院，批号100294－201203，纯度99. 4%)
DG(江苏正大天晴药业股份有限公司生产，商品名为甘利欣，主要成分为DG，批131206104)
2'，7 '－二氯荧光黄双乙酸盐(2'，7' -dichlorofluorescin diacetate，DCFH－ DA，美国Sigma- Aldrich公司) ，
Hoechst33258(美国Invitrogen公司) ，
改良Eagle高糖培养基( Dulbecco' s modification of Eagle' s medium Dulbecco，DMEM，Hyclone公司) ，
胎牛血清(Biological Industries公司) ，
细胞计数试剂盒( cell counting kit，CCK－8，WST公司) ，
0. 5%消化胰酶和细胞冻存液( Gibco公司) ，
In cell 2000型高内涵系统(美国GE公司) ，
VICTOR X5酶标仪( Perkin Elmer公司)。
方法
1
细胞培养
将L02置于常规培养皿内，以高糖DMEM培养基( 含10%胎牛血清) 、在37℃、5%CO2和相对湿度90%的培养箱内培养，培养基隔天更换，2～3d达到融合。本实验所用L02为5～9代。
2
TP对L02增殖抑制试验
L02悬液接种于96孔培养板( 每孔8000个细胞)过夜。
不同浓度TP溶液配制方法：
先用二甲基亚砜将TP粉末配制成10mg·mL－1的溶液，细胞实验当天，用细胞培养液稀释成终浓度为1. 5、5、15、50、100、150 和300μmol·L－1的溶液。
分设对照组( 空白细胞培养液) 及TP终浓度分别为1. 5、5、15、50、100、150 和300μmol·L－1的TP组，每孔200μL。
在37℃、5%CO2条件下孵育1、2、4h( 以下孵育条件相同) 后，用细胞培养液孵育24h后每孔加入CCK－820μL，孵育2h。
用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度(A) ，并计算细胞存活率= ( A给药组/A对照组) × 100%。
3
DG对TP诱导L02
毒性的保护作用
L02悬液接种于96孔培养板( 每孔8000个细胞) 孵育过夜。
不同浓度DG溶液配制方法：
DG注射液用细胞培养液稀释到所需浓度，终浓度为10、100和1000μmol·L－1的DG( 每孔200μL) 孵育48h后，
分设对照组及TP终浓度分别为1. 5、5、15、50、100、150 和300μmol·L－1的TP组( 每孔200μL) ，孵育1h后，用细胞培养液孵育24h后每孔加入CCK－820μL，孵育2h。
用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度(A) ，并计算细胞存活率= (A给药组/A对照组) × 100%。
4
TP诱导肝脏活性氧
及DG的保护作用
L02悬液接种于96孔培养板( 每孔8000个细胞) 孵育过夜。
终浓度10、100 和1000μmol·L－1的DG( 每孔200μL) 孵育48h 后，分设对照组及TP 终浓度分别为5、10、30 和100μmol·L－1的TP 组( 每孔200μL) ，孵育1h后，用PBS( 每孔200μL) 将L02洗3遍，分别加入DCFH－DA( 终浓度10μmol·L－1) 和Hoechst33258( 终浓度2. 5 μg·mL－1) 避光孵育30min，用冰PBS( 每孔200μL) 漂洗3遍，加入100μL冰PBS备检。
使用IN Cell Analyzer 2000HCA 分析仪。
检测条件如下：第一通道波长为360nm /460nm，照射Hoechst33342标记的细胞核; 第二通道波长为475 nm /535 nm，照射ROS 染料DCFH－ DA。
使用IN Cell Analyzer 2000Workstation3. 5图像分析软件，参数如下：细胞核和ROS荧光强度。
5
CYP3A4在TP
诱导肝毒性中的作用
L02悬液接种于96孔培养板( 每孔8000个细胞) 孵育过夜。
分设对照组，终浓度为25μmol·L－1的KN( CYP3A4 抑制剂)溶液组( 溶液配制方法：用二甲基亚砜配制成10mg·mL－1的储备液，然后用细胞培养液稀释到所需浓度) ，
终浓度为100μmol·L－1PT(CYP3A4 诱导剂)溶液组( 溶液配制方法：用二甲基亚砜配制成10mg·mL－1的储备液，然后用细胞培养液稀释到所需浓度) ，
终浓度为100μmol·L－1PT+ 25μmol·L－1KN溶液组( 溶液配制方法：用细胞培养液稀释相应储备液到所需浓度) ，每孔200μL。
孵育48h后，加入终浓度为10μmol·L－1的TP溶液( 每孔200μL) ，孵育1h后，用PBS( 每孔200μL)将L02洗3遍，分别加入DCFH－DA( 终浓度10μmol·L－1) 和Hoechst 33258 ( 终浓度2. 5μg·mL－1) ，避光孵育30min，用冰PBS( 每孔200μL)漂洗3 遍，加入200μL冰PBS备检。
采用“2. 4”项中描述的方法用IN Cell Analyzer 2000HCA分析仪。CYP3A4抑制剂和诱导剂的浓度根据本实验室以往实验结果选择可显著性抑制( 每孔200μL) CYP3A4活性的浓度作为本实验的浓度。
6
CYP3A4在DG保护
TP诱导肝毒性中的作用
首先将TP的化学结构输入ADMET Predictor软件，选择软件的代谢预测功能预测雷公藤甲素对CYP3A4活性的影响及是否为CYP3A4的底物。
L02悬液接种于96孔培养板( 每孔8000个细胞) 孵育过夜。
分设对照组，终浓度为100μmol·L－1的DG溶液组，终浓度为25μmol·L－1的KN溶液组，终浓度为100μmol·L－1DG + 25μmol·L－1KN溶液组，每孔200μL。
孵育48h后，加入终浓度为10μmol·L－1的TP溶液( 每孔200μL) ，孵育1h后，用PBS( 每孔200μL) 将L02洗3遍，分别加入DCFH－DA( 终浓度10μmol·L － 1 )和Hoechst33258( 终浓度2. 5μg·mL－1) ，避光孵育30min，用冰PBS( 每孔200μL) 漂洗3遍，加入200μL冰PBS备检。
使用“2. 4”项下描述的方法，用IN Cell Analyzer 2000HCA分析仪进行分析。
实验结果
1
TP对L02增殖的抑制作用
和DG的保护作用
CCK－8实验结果表明，TP显著性抑制L02的增殖，并呈明显的剂量依赖性( 图1) 。TP孵育1、2 和4h的IC50分别为26、14和8μmol·L－1。
DG10和100μmol · L－1预处理48h后，TP的IC50从26μmol·L－1分别增高至58和79μmol·L－1。
然而DG1000μmol·L－1预处理48h后，显著性增强该结果TP 的IC50从26到18μmol·L－1。
该研究表明DG浓度为10和100μmol·L－1时，DG提前孵育可显著降低TP引起的肝毒性。高浓度DG(1000μmol·L－1) 预处理48h，反而增强TP诱导L02的细胞毒性。
2
TP诱导L02产生ROS和DG的保护作用
用以前研究证明TP可以诱导L02产生ROS，从而诱发炎症导致细胞凋亡。
本实验研究细胞培养板规格了TP( 5、10、30和100μmol·L－1) 与L02直接孵育诱导的肝脏毒性; 并进一步比较了10、100 和1 000 μmol·L－1DG预处理48h后对TP诱导的肝脏细胞毒性的影响。
ROS检测采用DCFH－DA探针和Hoechst33258细胞核探针结合高内涵检测TP孵育1h后，诱导ROS的情况。
TP孵育1h后，其诱导ROS水平显示出一定的剂量相关性。10和100μmol·L－1DG预处理48h，诱导L02产生ROS的水平(DCF平均荧光强度)与TP直接孵育相比显著性降低。
然而，1000μmol·L－1DG预处理48h反而显著性增强TP诱导L02产生ROS的水平(图2) ，该结果与CCK－8细胞毒性结果一致。
DG通过降低TP诱导的ROS水平起到降低其毒性的作用。
3
CYP3A4上调显著性降低
TP诱导的正常肝细胞ROS
根据TP的分子式和固有化学性质，ADMET Predictor基于定量结构性质关系模型
(QSPR)预测发现TP通过CYP3A4进行代谢，并同时抑制CYP3A4的活性(图3) 。
进一步用实验验证CYP3A4在TP诱导L02产生ROS中的作用。
L02经CYP3A4诱导剂(PT) 预处理48h，TP(10μmol·L－1) 处理1h后，TP诱导L02产生ROS的水平与其直接孵育相比显著降低( 图3) 。
但当CYP3A4诱导剂PT和CYP3A4抑制剂KN同时与L02孵育48h，TP(10 μmol·L －1) 处理1h后，诱导L02产生ROS的水平与其直接孵育相比无明显变化KNCYP3A4抑制剂与L02孵育48h，TP( 10μmol·L－1) 处理1h后，TP诱导L02产生ROS的水平显著性高于TP直接与L02孵育( 图4) 。
该结果表明，上调CYP3A4可以有效降低TP诱导的正常肝细胞ROS水平。
4
DG显著性上调CYP3A4降低
TP诱导的正常肝细胞ROS
根据ADMET Predictor预测结果和以往文献报道，推测DG可以通过诱导CYP3A4从而起到保护L02的作用。
以下实验通过CYP3A4诱导剂PT和阻断剂KN来检验该预测的准确性。
DG(100μmol·L－1) 预处理正常肝细胞48h，TP(10μmol·L－1) 处理1h后，TP诱导L02产生ROS的水平与其直接孵育相比显著性降低( 图5) 。
当DG和CYP3A4抑制剂KN同时与L02孵育48h，TP(10 μmol·L－1) 处理1h后，TP诱导产生ROS的
水平与其直接孵育相比无明显变化。
KN与L02孵育48h，TP(10μmol·L－1处理4h 后，TP诱导L02产生ROS的水平显著性高于TP直接与L02孵育。
该结果表明，DG可能通过上调CYP3A4降低TP诱导的肝细胞ROS。
TP可能通过CYP3A4代谢，抑制CYP3A4的活性可显著提高TP对肝细胞的毒性，该结论需要进一步实验进行确证。
讨论
临床将TP用于治疗类风湿关节炎、肾病综合征、支气管哮喘、肿瘤等多种疾病，其疗效已被广泛认可，但是关于其对正常肝细胞的毒性研究并不多见。
以往研究表明，TP诱导L02凋亡，降低细胞中超氧化物歧化酶，提示雷公藤甲素破坏了细胞内的抗氧化防御体系，使得细胞中ROS相应地增多，细胞损伤作用增强。
甘草作为中药配伍中最常见的解毒中药，通过抗炎、抗氧化和上调肝药酶等机制与其他药物配伍产生减毒的效果。
以往研究表明，甘草可以显著性改变TP的代谢排泄，但甘草是否通过影响TP药代动力学改善雷公藤引起的肝脏副作用的研究目前仍为空白。
本实验选用DG和TP作为甘草和雷公藤的主要药效成分的代表，深入研究了DG对TP诱导的肝脏毒性的保护作用及可能机理。
本实验首先评价了DG对TP诱导的肝细胞毒性和诱导ROS的影响。
研究发现DG可以显著性降低TP诱导的肝细胞毒性，进一步用高内涵评价发现低、中剂量DG可有效抑制TP引起的L02ROS水平升高，而高剂量DG反而增强TP诱导L02的ROS水平。
已有研究揭示甘草酸具有抗炎抗氧化的药理作用。
本实验室以往的研究也提示，TP可诱导不同细胞凋亡并与活性氧簇生成有关，因此推测DG可以通过有效拮抗TP诱导的活性氧簇生成，从而发挥保护作用。
亦有临床研究发现DG在临床应用时会引起电解质紊乱和高血压等毒副作用。
本研究在DG高浓度组也观察到了毒性增强的现象，该研究结果说明高浓度DG 的潜在细胞毒性风险。
该研究结果为临床合理应用DG，控制其潜在毒性风险提供了理论支持。
既往文献指出TP可显著抑制肝药酶CYP3A4活力。
亦有研究发现DG预处理可以有效上调P450酶活性，因此DG有可能通过上调肝药酶提高TP代谢，从而起到最终降低其毒性的作用。
本研究进一步探索了CYP3A4在TP毒性和DG保护效应中的作用，ADMET Predictor代谢预测软件发现TP抑制肝药酶中最主要的CYP3A4的活性并且同时是CYP3A4酶的底物。
进一步应用CYP3A4酶的诱导剂和抑制剂双向验证发现诱导CYP3A4可显著降低TP 诱导正常肝细胞ROS。
DG与CYP3A4的诱导剂可以起到相同的降低TP诱导的ROS的作用，且加入CYP3A4阻断剂可有效逆转DG对TP诱导肝毒性的保护作用。
该研究提示DG通过上调CYP3A4从而起到降低TP诱导的正常肝细胞ROS的作用。
正常人肝细胞L02对TP诱导毒性的反应及DG对其的保护作用与本实验室以往研究的肝癌细胞HepG2差别明显。
TP诱导正常人肝细胞L02凋亡的IC50低于HepG2，显示出正常肝细胞对TP诱导毒性更为敏感。
同时低、中剂量DG对L02的保护作用明显，而高剂量却增加TP诱导毒性。
本实验同时用HepG2肝癌细胞研究了TP的毒性和DG的保护作用。
DG表现出剂量相关的保护作用，且高剂量DG的保护作用更强。
以往研究也表明，L02和HepG2对相同中药毒性反应存在差异。
TP和DG对肝细胞及肝癌细胞的作用差异及其毒效关系，还需要通过进一步试验加以证实和阐明。
综上所述，TP诱导L02凋亡，诱导ROS水平升高，这些都为解释雷公藤临床肝脏毒性提供了理论基础。
DG可以有效拮抗TP诱导的ROS水平，并通过上调CYP3A4的活性以降低TP产生的肝细胞毒性。
该结果为临床上减毒增效，合理应用雷公藤提供数据支持。
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说明
来源：药物分析杂志
Chin J Pharm Anal 2015， 35( 9)
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